Felhasznált állat: kecskebéka (Rana esculenta var. ridibunda)
Eszközök:
| 1 db nagyolló | 1 db kisolló | 2 db kiscsipesz |
| 2 db üvegpohár | 1 db Sartorius-edény | 1 db Pean |
| 1 db békatál | 1 db 0.2 g-os súly | 1 db Pasteur-pipetta |
| 1 db automata pipetta (1000 µl) | 1 db automata pipetta (200 µl) | 1 db békapad |
| 2 db 10 cm-es damil | 1 db elektromos ingerlő | papírvatta |
| 2 db horog | 1 db bonctű |
4.5. táblázat -
| béka-Ringer | Ca-mentes béka-Ringer | béka-Ringer |
| 15-szörös KCl tartalmú | ||
| 0.65 g NaCl | 0.65 g NaCl | 0.04 g NaCl |
| 0.04 g NaCl | 0.02 g KCl | 0.3 g KCl |
| 0.02 g CaCl2 | 0.01 g NaHCO3 | 0.02 g CaCl2 |
| 0.01 g NaHCO3 | ad 100 ml desztillált víz | 0.01 g NaHCO3 |
| ad 100 ml desztillált víz | ad 100 ml desztillált víz |
Acetilkolin (Hoffmann-La Roche, por)
Hígítás: 20 mg ACh+ 2 ml béka-Ringer (törzsoldat – 1.1 x 10-5 M)
Munkaoldatok:
1. 100 µl ACh törzsoldat+1900 µl béka-Ringer (5.5 x 10-7 M)
2. 200 µl ACh törzsoldat+1800 µl béka-Ringer (1.1 x 10-6 M)
3. 300 µl ACh törzsoldat+1700 µl béka-Ringer (1.7 x10-6 M)
4. 400 µl ACh törzsoldat+1600 l béka-Ringer (2.2 x 10-6 M)
Sósav 5% oldat
Tejsav 0.4% oldat
D-tubokurarin oldat (Curarine-Asta, Arduan, Richter Gedeon) ampulla 10 mg/ml
Strychnotonin (Chinoin) (Strychninum HCl) ampulla 1 mg/ml
A neuromuszkuláris szinapszis
a. Neuromuszkuláris junkció szerkezete: - velős motoros axon sokszorosan elágazik - izomrost felszínénél elveszti a velőshüvelyét - beágyazódik az izomrost felszínén lévő vájatba - idegvégződésben sok vezikula (ACh) és mitokondrium.
b. Motoros véglemez - az izomrost membrán speciális tulajdonságú, redőzött elrendeződésű.
c. A szinapszisban acetilkolin-észteráz van
d. Az ACh hatását a d-tubokurarin kompetitív módon gátolja.
Az összehúzódás lépései
1. A motoneuron kisülése.
2. Az acetilkolin felszabadulása az idegvégződésből.
3. Az ACh kötődése a véglemez nikotin típusú receptorához.
4. A véglemez Na+ és K+ konduktanciájának megnövekedése.
5. A véglemez-potenciál kialakulása.
6. Az akciós potenciál kialakulása az izomrost membránjában.
7. Az akciós potenciál beterjedése az izomrostokba a T-tubulusokon keresztül.
8. A Ca2+ felszabadulása a szarkoplazmatikus retikulum terminális ciszternáiból és diffúziója a vékony és vastag filamentumokhoz.
9. A Ca2+ kötődése a troponin C-hez, az aktin miozin-kötőhelyek szabaddá válása.
10. Az aktin és a miozin közötti kereszthidak kialakulása és a vékony filamentumok kontrakciót eredményező elcsúszása a vastag filamentumokon.
Az elernyedés lépései
1. A felszabadult Ach lebontása.
2. A Ca2+ visszavétele a szarkoplazmatikus retikulumba.
3. A Ca2+ disszociációja a troponinról.
4. Az aktin és a miozin közötti kölcsönhatás megszűnése.
A mozgató véglemez működését gátló hatóanyagok
Membránstabilizáló izomrelaxánsok: a véglemez nem depolarizálódik az ingerületkor felszabaduló ACh hatására, mert a vegyület kompetitíve gátolja az ACh receptorához való kötődését (pl. D-tubokurarin, gallamin).
Depolarizáló izomrelaxánsok: hatásukra a véglemez és környéke tartósan depolarizálódik, és ezért válik az ingerület hatástalanná (pl. dekametónium, diacetilkolin).
A megfigyelhető jelenségek
Ingerküszöb megállapítása indirekt ingerléssel Négyszögingerlő használatakor az idegre egyes impulzusokat adunk. Megkeressük azt a legkisebb feszültséget, amely még éppen összehúzódást vált ki.
Maximális ingererősség megállapítása Növeljük fokozatosan kis lépésekben az ingerlő feszültséget. Az összehúzódás mértéke bizonyos határig növekszik (maximális inger, az idegköteg különböző ingerküszöbű rostokból áll).
Ingerszummáció Ha szubminimális erősségű ingereket (amelyek már éppen nem váltanak ki összehúzódást) gyors egymásutánban adunk, ingerszummáció jön létre, vagyis a hatástalan ingerek sorozatban történő adása összegződés révén kontrakciót vált ki.
Szuperpozíció, tetanusz A képernyőn hasonlítsuk össze az egyetlen maximális impulzusra adott rángás magasságát több, gyors egymásutánban adott ingerre bekövetkező kontrakció magasságával. Szuperpozíció jön így létre: a kontrakció nagyobb lesz, mint az egyes ingert követően. Legnagyobb kontrakciót akkor kapunk, ha az impulzusokat elválasztó időtartam a rángási időnek kb. a fele vagy annál valamivel rövidebb (komplett tetanusz). Ha a két inger közötti idő olyan hosszú, hogy az izomnak módja van némi elernyedésre, a kontrakciós görbe csipkézett lesz (tökéletlen v. inkomplett tetanusz).
Fáradási görbe felvétele A fáradás az egyes kontrakciók nagyságának csökkenésében és a kontrakciós idő hosszabbodásában nyilvánul meg, végül az izom teljesen kifárad. Az indirekt ingerléssel teljesen kifárasztott neuromuszkuláris apparátus direkt ingerléssel még működésre bírható, mert az apparátusban a szinapszis fárad ki először. Megfelelő ideig pihentetett és nedvesen tartott ideg-izom preparátum restituálódik, újra működőképessé válik.
Béka ideg- izom preparátum preparálása
A békát dekapitáljuk, gerincvelejét bonctűvel elroncsoljuk. Ügyeljünk arra, hogy a végtagok teljesen ellazuljanak. Ezután a békát bonctálban a hátoldalára fektetjük, majd a processus xyphoideustól kiindulva a vállak felé háromszög alakú bemetszést ejtünk, és a hasüreget megnyitjuk. Eltávolítjuk a zsigereket (evisceraljuk), majd kb. a szegycsont magasságában a békát kettévágjuk.
Papírvatta segítségével egyik kezünkkel megfogjuk az alsó testfél gerincoszlopcsonkját, másik kezünkkel pedig szintén papírvattával a hátoldalon megfogjuk a bőrt és egyetlen határozott rántással lehúzzuk azt. Vigyázzunk arra, hogy se a kezünkön, se az eszközökön békabőr-váladék ne maradjon, mert ez az izmok és idegek működését erősen gátolja. A zsigerek eltávolítása után jól láthatók a gerincvelőből kilépő n.ischiadicus kötegei. Az idegeket közvetlenül a gerincvelőből való kilépésük után fonalra vesszük, a kötés fölött átvágjuk, majd finom olló segítségével a medencébe való belépéséig felpreparáljuk. Ezután egy nagyobb olló segítségével a medencecsontot átvágjuk, majd a flexor csoport izmait tompán szétbontjuk. Az ideget a térdhajlatig felpreparáljuk. A combcsontról az izmokat lefejtjük, majd a combcsontot a medencéhez közel átvágjuk. Az Achilles-ínra fonalat kötünk és a m. gastrocnemiust a térdizületig felpreparáljuk. Ezután a lábszárat a térdizület alatt átvágjuk. Így egy ún. ideg-izom preparátumot kapunk, mely a gastrocnemius izomból és az azt beidegző ischiadicus idegből, valamint a térdizületből áll.
Musculus sartorius preparálása
1. A békát dekapitáljuk, gerincvelejét elroncsoljuk.
2. Bonctálban hátoldalára fektetjük és hosszanti metszéssel megnyitjuk a hasüreget.
3. Eltávolítjuk a zsigereket.
4. A szegycsont magasságában a békát kettévágjuk.
5. Papírvattával megfogjuk a gerincoszlop csonkját valamint a hátoldalon a bőrt és egyetlen határozott rántással lehúzzuk azt.
6. Megkeressük a comb ventrális felszínén futó m. sartoriust, a térdízületnél levő inas részt felszabadítjuk, az előkészített rövid előkés horgot beleakasztjuk vagy damilt kötünk rá.
7. A kötés alatt az inat átvágjuk és az izmot a damillal felemelve a symphysisen levő eredésig felpreparáljuk.
8. A felső ínba a nagyobbik előkés horgot beleakasztjuk vagy damillal megkötjük, úgy, hogy izomrész ne kerüljön a kötésbe, majd a kötés felett az inat átvágjuk.
9. A Sartorius edényt feltöltjük Ringer oldattal.
10. Az izolált m. sartorius alsó végét a meghurkolt fonal segítségével a sartorius edény alsó felében lévő kampóba akasztjuk, míg a felső részére kötött hurkot az érzékelőre.
11. Az izmot enyhén megfeszítjük.
A kísérlet menete
1. A preparálás után min. 10 percet pihentetni kell az ideg-izom preparátumot.
2. Az Acquisition/Monstart aktiválása.
3. A Record gombbal a számítógép felvételi készenlétbe helyezése.
4. A baloldali ablak az elsődleges, míg a jobboldali a másodlagos jeleket mutatja.
5. CTRL1 elindítása (egér) - sárga színűre változik a mérővonal.
6. Min. 30 mp regisztrálás.
7. Adm1 aktiválása.
8. Ezzel egyidejűleg 200 µl anyag beadása (ACh1 dózis).
9. Regisztrálás a hatás lecsengéséig (max: 2 perc).
10. Stop gombbal a regisztráció leállítása.
11. Mosás kétszer (szövetfürdő cseréje).
12. 5 perc várakozás.
13. Mosás.
14. 5 perc várakozás. 15. CTRL2 aktiválása.
16. lásd 6-14 pontig (ACh2-ACh4 dózisig).
17. Kísérlet végén az EDR megnyomása (Csak a másodlagos jeleket mutató képernyőre érvényes).
18. 10 perc várakozás.
Egyéb anyagok vizsgálata az izompreparátumon
Kálium kontraktúra vizsgálata
1. Log gomb megnyomása (névadás).
2. A fürdőfolyadék 15-szörös KCl tartalmú béka-Ringer oldattal való kicserélése.
3. A hatás végén a Log gomb ismételt megnyomásával a regisztrálás leállítása.
Ca-hiány vizsgálata
1. Log gomb megnyomása (névadás).
2. A fürdőfolyadék Ca-mentes béka-Ringer oldattal való kicserélése.
3. A hatás végén a Log gomb ismételt megnyomásával a regisztrálás leállítása.
Sósav, tejsav hatásának vizsgálata (irreverzibilis változást okozó ágensek!)
1. Log gomb megnyomása (névadás).
2. A fürdőfolyadékba pár cseppet adni az oldatokból.
3. A hatás végén a Log gomb ismételt megnyomásával a regisztrálás leállítása.
D-tubokurarin-hatás vizsgálata (irreverzibilis változást okozó ágens!)
1. Kontrol állapot felvétele a Log gombbal, az elektromos ingerlés paramétereinek rögzítése a jegyzőkönybe.
2. A fürdőfolyadék 1 %-os D-tubokurarin-tartalmú Ringer oldattal való kicserélése. Kb. 1 óra várakozás.
3. A hatás jelentkeztével azonos elektromos ingerlés mellett új regisztráció a Log gomb megnyomásával.